(C/N:CE604)

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1．概要

软骨藻酸（Domoic acid，DA）是一种天然神经性氨基酸，要由某些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻产生，人们食用毒化的贝类，可引起记忆丧失、眩晕、昏迷甚至死亡等症状，根据这种毒素的中毒特征，被命名为记忆丧失性贝毒（Amnesic Shellfish Poisoning，ASP）。研究发现，贝组织中软骨藻酸含量达到40mg／kg时可引起食用者中毒，150mg／kg 时有致死危险，人类通过进食可耐受的最大为20mg/kg。

2．原理

本试剂盒采用间接竞争法。酶标板微孔中预包被软骨藻酸毒素抗原，样品中残留的软骨藻酸毒素与微孔板上的抗原竞争软骨藻酸毒素抗体，加入酶标二抗后，用TMB显色，吸光值与样品中软骨藻酸毒素含量成负相关。

3．试剂盒组成

1）包被有抗原的96微孔板：1块（96孔，12条×8孔）

2）标准品工作液：0、0.3、1.0、3.0、9.0ng/mL        1瓶x1mL

3）软骨藻酸毒素抗体：        1瓶x8mL

4）酶标二抗：        1瓶x15mL

5)        10x浓缩洗涤液：        1瓶x50mL

6）样本希释夜：        2瓶×50mL

7）显色底物液（TMB）：        1瓶×17mL

8）终止液：        1瓶×7mL

9）试剂盒说明书

10）质检报告

4．需要的仪器、试剂

1）仪器

酶标仪450nm（iELisa全自动酶标仪或相当者）

离心机

微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL

-50mL离心管、8道微量移液器酶标板振荡器 

天平：感量0.01g

2）试剂

去离子水

甲醇

5．样品处理

5.1贝类样本

1）去除贝壳取出贝肉，将贝肉样本均质；

2）称取1.0g均质好的样本于10mL离心管中；

3）加入4mL50％甲醇水，剧烈震荡5min；

4）室温4000r／min离心10分钟；

5）取上清液20μL到980μL样本希释夜中，混匀；

6）取50μL混匀液用于检测。

稀释倍数：200

6．酶联免疫分析程序

6.1测定之前注意事项

1）使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。

2）使用后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。

3）在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4）所有孵育过程应避免阳光直射，并按要求用盖板覆盖住酶标板。

6.2 溶液的配制

1）洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用去离子水稀释10倍后使用（1份浓缩洗涤液加9去份离子水）。

2） 50％甲醇水的配制：量取50mL甲醇加入50mL 去离子水。

6.3测定程序

1）将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。

2）分别吸取50μL标准品和样品加至相应的微孔（双孔）中，然后各加入50μL软骨藻酸毒素抗体加盖，室温温育30分钟（每个标准品和样品必须使用新的吸头）。

3）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证除去孔中的液体，然后每孔加入250μL 稀释好的洗涤液洗涤，振荡后倒出孔中的液体，拍干；重复操作四次，洗板时每次间隔30秒，洗完后用力在吸水纸上拍干。

4）加入100μL酶标二抗抗体加盖，室温温育30分钟（每个标准品和样品必须使用新的吸头）。

5）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证除去孔中的液体，然后每孔加入250μL 稀释好的洗涤液洗涤，振荡后倒出孔中的液体，拍干；重复操作四次，洗板时每次间隔30秒，洗完后用力在吸水纸上拍干。

6）每孔加入100μL底物，室温避光温育10分钟。

7）每孔加入50μL终止液，混匀。

8）置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值），参比波长630nm。（iELisa 全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。

7．结果判定

1）所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准品（0标）的吸光度值（Bo）再乘以100％，即百分吸光度值。百分吸光度值

以软骨藻酸毒素标准品浓度值（ppb）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

2）样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍数。 

3）如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一定的比例用稀释缓冲液进行稀释。

8．注意事项

1）室温低于20℃或试剂及标本未回到室温（20-25℃）会导致数值偏低。

2）在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3）标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在光线下。

4）混合要均匀，洗板要充分（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。

5）反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。

6）不要使用过期的试剂盒，也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起灵敏度降低。 

7）试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。

9．检测方法灵敏度、准确度、精密度、交叉反应率

1）精密度：批内变异系数＜10％(n=10)

批间变异系数＜25％（n＝10）

2）灵敏度：0.3ng／mL。

3）样本检测线：

贝类        60ng/mL

4）准确度：

贝类        90%±25%

5）交叉反应率：

软骨藻酸        100%